mRNA生(shēng)物制(zhì)品質量控制(zhì)家(jiā)族成員全新亮相

發布時(shí)間(jiān)：2023-08-28 浏覽次數(shù)： 加載中...

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mRNA藥物是通(tōng)過将編碼抗原蛋白的mRNA接種到人(rén)體(tǐ)，利用人(rén)體(tǐ)細胞內(nèi)的遺傳物質進行(xíng)表達合成抗原蛋白，通(tōng)過抗原蛋白誘導和(hé)激活機體(tǐ)的免疫系統産生(shēng)免疫反應，從而達到預防和(hé)治療疾病的目的。

由于其具有(yǒu)較低(dī)的感染和(hé)突變風險，能夠同時(shí)誘導産生(shēng)體(tǐ)液免疫和(hé)細胞免疫，免疫效能好，研發和(hé)生(shēng)産周期短(duǎn)，容易實現量産等特點，目前被廣泛用于傳染性疾病、腫瘤及罕見病藥物的研發。

通(tōng)過酶促體(tǐ)外轉錄法制(zhì)備大(dà)量mRNA的工藝已經成熟，其中規模化生(shēng)産過程中主要涉及的工具酶有(yǒu)T7 RNA Polymerase、DNase Ⅰ、RNase Inhibitor、無機焦磷酸酶等，這些(xiē)酶的靈活使用極大(dà)的方便了生(shēng)産流程，加速科學家(jiā)們研究進展。

mRNA規模化生(shēng)産中的工具酶

NO.1

T7 RNA Polymerase

T7 RNA聚合酶是由T7噬菌體(tǐ)DNA編碼的，一種DNA依賴性的RNA聚合酶，具有(yǒu)高(gāo)度啓動子專一性，可(kě)催化以T7啓動子序列為(wèi)起點 5’→ 3’方向的RNA合成，在mRNA藥物研發中常以其催化目的基因的體(tǐ)外合成，轉錄效率和(hé)産量高(gāo)，市面上(shàng)由其催化的1μg DNA模闆可(kě)轉錄出150-200μg的RNA。

NO.2

DNase I

脫氧核糖核酸酶I，是一種可(kě)以消化單鏈或雙鏈DNA産生(shēng)單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶，可(kě)以用于各種RNA樣品的處理(lǐ)，消化由T7 RNA聚合酶催化的體(tǐ)外轉錄後的DNA模闆，65℃加熱10分鍾可(kě)使DNaseI失活。

NO.3

RNase Inhibitor

RNase（Ribonuclease，核糖核酸酶）是一類能夠催化RNA降解為(wèi)小(xiǎo)分子RNA的核酸酶，廣泛存在于真核、原核生(shēng)物的所有(yǒu)細胞和(hé)組織中，通(tōng)常有(yǒu)極強活性，RNA樣本中微量的RNase污染足以導緻其完全降解。為(wèi)了減少(shǎo)RNA的損失，适當添加RNase抑制(zhì)劑（RNase inhibitor）是有(yǒu)必要的。

RNase抑制(zhì)劑是人(rén)的胎盤中存在的一種特異性核糖核酸酶(RNase)抑制(zhì)劑，能夠特異地與RNase以非共價鍵結合形成複合體(tǐ)從而使RNase失活。

NO.4

無機焦磷酸酶

多(duō)種代謝反應會(huì)産生(shēng)無機焦磷酸，Pyrophosphatas無機焦磷酸酶（PPase）可(kě)水(shuǐ)解無機焦磷酸鹽，可(kě)以避免無機焦磷酸對反應的抑制(zhì)，并且提供熱力學動力促使反應向正向進行(xíng)，從而常用于RNA體(tǐ)外轉錄、DNA複制(zhì)和(hé)擴增如HDA或LAMP等溫擴增等。

尤其在工業化生(shēng)産mRNA疫苗的時(shí)候會(huì)産生(shēng)大(dà)量的無機焦磷酸鹽，為(wèi)了保證mRNA疫苗高(gāo)效生(shēng)産，可(kě)以添加無機焦磷酸酶，解除生(shēng)成的無機焦磷酸鹽對反應體(tǐ)系的抑制(zhì)。

dsRNA

添加相關工具酶還(hái)會(huì)帶來(lái)其他影(yǐng)響，例如使用 T7 RNA 聚合酶合成RNA的技(jì)術(shù)目前已經很(hěn)成熟，但(dàn)之前的研究已經确定了體(tǐ)外合成過程中某些(xiē)副産物的存在，這些(xiē)副産物會(huì)觸發細胞免疫反應，包括雙鏈 RNA (dsRNA)，這已被證明(míng)成為(wèi)免疫通(tōng)路的主要觸發。

檢測mRNA生(shēng)物制(zhì)品中殘留的必要

大(dà)多(duō)數(shù)工具酶的使用能幫助我們獲得(de)大(dà)量的RNA，但(dàn)工具酶本身對于藥物成品來(lái)說亦是一種雜質，這些(xiē)雜質與mRNA一起通(tōng)過LNP包封進入細胞釋放後，極有(yǒu)可(kě)能産生(shēng)高(gāo)強度的免疫原性從而連帶引發mRNA的降解。以及産生(shēng)的雙鏈RNA (dsRNA)雜質具有(yǒu)潛在的免疫原性，對患者有(yǒu)害。因此，mRNA相關制(zhì)品需要測定和(hé)控制(zhì)工具酶和(hé)dsRNA的含量。

相關法規要求與檢測方法

——mRNA類的質量标準可(kě)以納入外觀、pH值、含量、鑒别、序列分析、mRNA完整性、加帽率、poly（ A）長度及分布、生(shēng)物學活性、無菌檢測、細菌內(nèi)毒素、雙鏈 RNA殘留、溶劑殘留等檢測項目。

體(tǐ)外基因修飾系統藥學研究與評價技(jì)術(shù)知道(dào)原則（試行(xíng)）

--2022年05月

——mRNA等通(tōng)過體(tǐ)外轉錄方式制(zhì)備的核酸産品，可(kě)通(tōng)過對原材料、轉錄模闆和(hé)轉錄條件的研究，控制(zhì)轉錄産物的質量。轉錄用的重要原材料，如核苷酸、修飾核苷酸、 5’-帽或類似物、工具酶（如轉錄酶等）等應進行(xíng)适當的質量控制(zhì)，可(kě)關注其純度和(hé)雜質，轉錄酶還(hái)需關注其保真度等。

轉錄模闆的制(zhì)備應能确保模闆的序列準确性和(hé)純度，減少(shǎo)雜質殘留。體(tǐ)外轉錄條件應經過充分的研究，提高(gāo)轉錄序列的準确性、均一性和(hé)完整性，減少(shǎo)副反應産物，如不完整 RNA、雙鏈RNA、截短(duǎn)RNA、長鏈RNA等的形成。

體(tǐ)內(nèi)基因修飾系統藥學研究與評價技(jì)術(shù)指導原則（試行(xíng)）

--2022年05月

CDE發布的指導原則《新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學研究技(jì)術(shù)指導原則（試行(xíng)）》以及美國藥典（USP）發布的《mRNA疫苗質量分析方法》的指南草案中（見下圖）指出:需要對整個(gè)工藝進行(xíng)質量控制(zhì)，保證質量有(yǒu)效、安全可(kě)控。

其指導原則中還(hái)規定，需要對其生(shēng)産工藝相關雜質進行(xíng)檢測，對主要雜質進行(xíng)監測與分析，需要更強大(dà)的評估方法來(lái)确保最終産品的質量和(hé)安全。其中對T7 RNA和(hé)dsRNA的殘留進行(xíng)了明(míng)确規定。

疫苗行(xíng)業

美國藥典(USP)發布的《mRNA疫苗質量分析方法》指南草案

由于mRNA技(jì)術(shù)的應用相對較新，在藥物研發和(hé)制(zhì)造過程中指導mRNA質量研究與控制(zhì)方面的監管指南和(hé)行(xíng)業标準仍在不斷發展。

BlueKit産品信息

産品特點

檢測靈敏度高(gāo)，檢測限達到ng級及以下

精密度高(gāo) CV% ≤ 10%, RE% ≤ ±15%

試劑盒使用簡便易上(shàng)手

貨号	檢測試劑盒	購買周期
HG-TP001	T7 RNA Polymerase ELISA檢測試劑盒	現貨 Off the shelf
HG-DI001	DNase I ELISA檢測試劑盒	現貨 Off the shelf
HG-RI001	RNase Inhibitor ELISA檢測試劑盒	現貨 Off the shelf
/	無機焦磷酸酶 ELISA檢測試劑盒	即将上(shàng)新
HG-DS001	dsRNA ELISA檢測試劑盒	現貨 Off the shelf