超濾法制(zhì)備外泌體(tǐ) | Amicon® Ultra超濾管應用方案

發布時(shí)間(jiān)：2023-10-30 浏覽次數(shù)： 加載中...

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默克Amicon^®Ultra 超濾管采用低(dī)蛋白吸附的Ultracel^®再生(shēng)纖維素超濾膜，确保更精準的截留分子量和(hé)更高(gāo)的蛋白回收率。因其優異的性能，Amicon^®Ultra 超濾管已被廣泛應用于多(duō)種樣品制(zhì)備的場(chǎng)景，包括蛋白/抗體(tǐ)/酶/核酸等生(shēng)物樣本的濃縮、脫鹽和(hé)緩沖液置換、病毒/噬菌體(tǐ)/外泌體(tǐ)/囊泡/微粒等樣本的純化、藥物篩選、藥物結合實驗、蛋白富集、小(xiǎo)分子物質去除、分析樣品前處理(lǐ)等，為(wèi)科學研究提供高(gāo)效的創新方案。

外泌小(xiǎo)體(tǐ)（Exosome）是一種囊泡結構，直徑通(tōng)常在30-150nm，常見于正常體(tǐ)液和(hé)病理(lǐ)樣本，培養細胞也可(kě)分泌。研究人(rén)員已經在血液、唾液、尿液、母乳等中發現外泌小(xiǎo)體(tǐ)，其運載的蛋白和(hé)核酸涉及其細胞間(jiān)物資、信息交流，影(yǐng)響和(hé)調控着多(duō)方面的生(shēng)理(lǐ)功能，包括腫瘤發生(shēng)、免疫促進、凋亡調控、血管生(shēng)成、炎症反應及發育和(hé)分化等。由于在體(tǐ)液中出現，外泌小(xiǎo)體(tǐ)對于臨床生(shēng)物标志(zhì)物檢測特别有(yǒu)利，成為(wèi)體(tǐ)外診斷、biomarker研究的新熱點。

之前我們有(yǒu)文章介紹通(tōng)過PS（磷酯酰絲氨酸）親和(hé)法提取外泌體(tǐ)，今天給大(dà)家(jiā)介紹另外一種提取外泌體(tǐ)的方法——超濾法。說到超濾，那(nà)就不得(de)不提默克的超濾管了，默克Amicon^®Ultra 系列超濾管相信大(dà)家(jiā)基本都有(yǒu)所了解，很(hěn)多(duō)老師(shī)應該都有(yǒu)用過，無論是質量還(hái)是口碑在業內(nèi)都是遙遙領先的！

超濾法提取外泌體(tǐ)

兩步法細胞上(shàng)清的外泌體(tǐ)分離

操作(zuò)步驟：從細胞培養上(shàng)清中制(zhì)備外泌體(tǐ)

步驟01

樣品澄清

1、将培養基上(shàng)清從培養瓶中轉移到50ml錐形管中；

2、旋緊Steriflip^®組件（貨号:SCGP00525，0.22µm，PES膜）至樣品管頂部，打開(kāi)樣品管末端；

3、倒置組件并固定在基座或架子上(shàng)；

4、将調節真空(kōng)源連接到Steriflip^®裝置側面的真空(kōng)端口上(shàng)。打開(kāi)真空(kōng)使溶液通(tōng)過膜進入空(kōng)管；

5、拆下Steriflip^®裝置并蓋上(shàng)樣品。将過濾後的樣品保存在4°C或進行(xíng)囊泡富集。

本離心超濾方案基于使用AU-15超濾管（10kDa MWCO，#UFC901024）處理(lǐ)15mL樣品。如果要使用不同的體(tǐ)積或超濾管規格（AU-0.5，AU -2或AU-4mL），請(qǐng)參閱相應的Amicon^®Ultra超濾管使用說明(míng)書(shū)。

步驟02

超濾管平衡

1、向超濾管中加入2ml PBS，蓋上(shàng)蓋子，在4,000xg的擺桶轉子中離心10分鍾；

• 對于AU-2和(hé)AU-4，可(kě)以使用相同的離心機轉速。如果要使用固定角度轉子，請(qǐng)查閱設備用戶指南以獲得(de)适當的轉速和(hé)體(tǐ)積限制(zhì)。
• 對于AU-0.5，樣品在可(kě)容納1.5mL管的固定轉子中以14,000xg離心。

2、移去超濾裝置底部未過濾的PBS，抽取收集管裏的濾液。

• 對于AU-2、AU-4和(hé)AU-15，可(kě)通(tōng)過移液器(qì)去除濾液。
• 對于AU-0.5，可(kě)1000 x g 反轉離心2分鍾去除濾液，移除收集管中PBS或更換新的收集管。

步驟03

樣品超濾

1、像AU-15超濾管中加入15ml樣品，蓋上(shàng)蓋子；

2、 4,000xg離心30分鍾；

備注：終産品體(tǐ)積通(tōng)常大(dà)約500µL（30倍濃度），但(dàn)根據樣品的性質、流速和(hé)離心時(shí)間(jiān)可(kě)能會(huì)有(yǒu)所不同。有(yǒu)關樣品體(tǐ)積和(hé)終體(tǐ)積的估計(jì)，請(qǐng)參閱對應Amicon^®Ultra超濾管使用說明(míng)書(shū)。

3、從離心機上(shàng)取下超濾裝置，棄除收集管裏的液體(tǐ)；

4、往過濾裝置中加入14mL PBS，移液器(qì)輕輕吸吐多(duō)次。4,000xg離心30分鍾；
5、從過濾裝置中回收濃縮樣品；
• 對于AU-2、AU-4和(hé)AU-15，可(kě)用移液器(qì)吸取樣品，并多(duō)次沖洗膜側壁（每側3-4次）以确保完全回收。
• 對于AU-0.5，将過濾器(qì)倒扣在幹淨的離心管中。在2000xg下離心1分鍾，将樣品轉移到試管（反向旋轉）。

6、細胞外囊泡樣品準備好進行(xíng)分析。

注意事項及補充提示：

• 無血清樣品選擇3kDa孔徑是為(wèi)了盡可(kě)能提高(gāo)外泌體(tǐ)的回收率；
• 有(yǒu)血清樣品選擇100kDa/500kDa孔徑是為(wèi)了盡可(kě)能去除細胞分泌蛋白以及血清成分中小(xiǎo)于外泌體(tǐ)的白蛋白造成的影(yǐng)響；
• 研究者可(kě)根據樣品的粘稠程度，以及需要制(zhì)備的目标外泌體(tǐ)/囊泡/顆粒的大(dà)小(xiǎo)分布來(lái)選擇和(hé)優化超濾孔徑（3kDa/10kDa/30kDa/50kDa/100kDa），以便達到更好的得(de)率和(hé)操作(zuò)體(tǐ)驗；
• 樣品體(tǐ)積大(dà)于30mL時(shí)可(kě)以考慮用超濾杯或Centricon plus -70超濾管，請(qǐng)注意攪拌式超濾杯在200mL以內(nèi)時(shí)吸附損耗可(kě)能較離心式超濾管略偏高(gāo)；
• 如需進一步提高(gāo)特定外泌體(tǐ)的純度，可(kě)選用包被相應抗體(tǐ)的磁珠進行(xíng)親和(hé)純化精制(zhì)。

超濾法制(zhì)備的外泌小(xiǎo)體(tǐ)參考數(shù)據

多(duō)維度分析4個(gè)SH-SY-5Y細胞系的外泌小(xiǎo)體(tǐ)樣品（含或不含血清）：