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病毒濃縮 | Amicon® Ultra超濾管應用方案

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2023

基 因 治 療

基因治療是通(tōng)過将特定的細胞功能改變的遺傳物質引入患者來(lái)治療遺傳疾病。根據給藥的方式可(kě)以分為(wèi)：體(tǐ)內(nèi)基因治療（in vivo）和(hé)體(tǐ)外基因治療（in vitro）。

 

  • 體(tǐ)內(nèi)基因治療指将攜帶治療性轉基因的載體(tǐ)直接注入患者體(tǐ)內(nèi)。

  • 體(tǐ)外基因治療包括從患者的細胞或異體(tǐ)來(lái)源提取細胞，通(tōng)過攜帶治療性轉基因的載體(tǐ)進行(xíng)基因修飾，再将該工程細胞重新導入患者體(tǐ)內(nèi)。

 

基因治療的關鍵步驟是如何有(yǒu)效地通(tōng)過遞送載體(tǐ)将基因傳遞到目标組織/細胞。根據載體(tǐ)的屬性分為(wèi)：病毒類遞送載體(tǐ)和(hé)非病毒類遞送載體(tǐ)。不同細胞類型的轉染效率差異很(hěn)大(dà)。因此，已經開(kāi)發了多(duō)種病毒來(lái)源的載體(tǐ)系統，用于改善哺乳動物細胞中的cDNA轉導、表達和(hé)篩選。這些(xiē)系統包括COS細胞中的猿病毒40複制(zhì)子(SV40)以及源自逆轉錄病毒、杆狀病毒、甲病毒、人(rén)類免疫缺陷病毒、牛痘病毒、腺病毒和(hé)腺相關病毒（AAV）的cDNA克隆和(hé)表達載體(tǐ)。以逆轉錄病毒、腺病毒(Ads)或腺相關病毒(AAVs)的使用最為(wèi)廣泛。

 

在臨床試驗中使用病毒載體(tǐ)相關的挑戰包括生(shēng)産足夠數(shù)量的臨床級材料和(hé)維持病毒載體(tǐ)的生(shēng)物安全性。病毒載體(tǐ)的生(shēng)産和(hé)純化在方法和(hé)病毒産量和(hé)質量方面各不相同。病毒載體(tǐ)的生(shēng)成和(hé)純化是勞動密集型的且昂貴的，并且可(kě)能需要特殊設備（如超速離心機）。純化腺病毒、慢病毒和(hé)AAV的标準方法是使用密度梯度超速離心，然後進行(xíng)長時(shí)間(jiān)透析。近年來(lái)柱或膜層析已成為(wèi)腺病毒純化的首選方法。病毒的産量通(tōng)常通(tōng)過空(kōng)斑試驗、TCID50測定和(hé)ELISA來(lái)确定。對于大(dà)多(duō)數(shù)應用，重組病毒必須純化至高(gāo)滴度。為(wèi)了獲得(de)高(gāo)滴度原液，通(tōng)常需要濃縮純化的病毒顆粒。

 

之前我們有(yǒu)文章介紹了使用默克Amicon®Ultra超濾管分離提取外泌體(tǐ)，今天給大(dà)家(jiā)介紹超濾管的其它應用-濃縮病毒！下面介紹使用Amicon®Ultra離心超濾裝置濃縮三種常見的病毒類型：慢病毒，腺病毒和(hé)腺相關病毒（AAV）。

 

01
 
實驗步驟 
 
 

 

 
01
 
包裝細胞

宿主細胞鋪闆以達到80-85%的彙合度。

02
 
轉染

細胞轉染重組質粒或感染活病毒顆粒。

03
 
收獲病毒

根據病毒的不同，使用細胞上(shàng)清液或沉澱細胞或兩者兼而有(yǒu)之來(lái)純化重組病毒粒子。通(tōng)常應用三到四輪凍融循環從細胞中釋放病毒。然後通(tōng)過離心或預過濾将細胞碎片與細胞裂解物分離。

04
 
病毒純化

通(tōng)過密度梯度超速離心或柱/膜層析從細胞裂解物中純化病毒。在某些(xiē)情況下可(kě)以使用肝素或粘蛋白瓊脂糖的親和(hé)色譜。然後将純化的病毒溶液通(tōng)過透析或滲濾完成将緩沖液置換成适當的儲存溶液。

05
 
病毒濃縮

為(wèi)了獲得(de)高(gāo)滴度的病毒原液，可(kě)以使用離心超濾濃縮純化的病毒。

 

 

備注： 正确選擇設備、膜材料、MWCO、離心速度、離心時(shí)間(jiān)和(hé)緩沖液組成對于感染性病毒顆粒的高(gāo)回收率至關重要。

 

Amicon®Ultra超濾管采用50KDa NMWL Ultracel® 再生(shēng)纖維素膜，已被證明(míng)可(kě)以成功濃縮腺病毒和(hé)AAV溶液。對于慢病毒濃度，可(kě)以使用50KDa和(hé)100kDa膜的超濾管。

 

 

02
 
實驗結果 
 
 

 

下表顯示了粗制(zhì)細胞裂解物和(hé)色譜純化的病毒中腺病毒、慢病毒和(hé)AAV濃度的典型結果。

 

表1：采用Millipore®超濾産品濃縮病毒

 

特别注意

①我們不建議将病毒濃縮到超過1013顆粒/mL的濃度， 以避免可(kě)能出現的病毒聚集。

 

②大(dà)多(duō)數(shù)病毒不能有(yǒu)效地濃縮并儲存在低(dī)鹽緩沖液中。病毒在濃度為(wèi)<250mM鹽濃度的溶液中離心将導緻病毒聚集和(hé)傳染性降低(dī)。 推薦儲存溶液配方是： 20mM Tris、pH8.0、250mM NaCl、5%山(shān)梨糖醇和(hé)0.001% PF68（多(duō)聚糖酸）。

 

濃縮的病毒原液也可(kě)以通(tōng)過0.22μm過濾器(qì)進行(xíng)過濾滅菌。例如，無菌Steriflip-GP® 過濾裝置（目錄号SCGP00525）可(kě)用于50mL或以下的體(tǐ)積或Ultrafree® MCGV（目錄号UFC30GV0S）可(kě)用于體(tǐ)積<0.5mL的樣品。對于較大(dà)體(tǐ)積的樣品，則可(kě)使用70%消毒處理(lǐ)過的Amicon® Ultra或Centricon® Plus 70超濾管濃縮。

 

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産品數(shù)據來(lái)源默克生(shēng)命科學産品和(hé)服務解決方案-SigmaAldrich

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